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Peptide Synthesis


1.       多肽合成的本原理?

2.       多肽定制服务的质量如何制?

3.       吉尔多肽的生产能力以及交货时间如何?

4.       常用什么方法生产多肽?

5.       对不同的实验,如何选择肽的纯度?

6.       什么是多肽的净含量(肽含量),它的意义是什么?

7.       如果我的肽纯度是95%,那么,其余的5%都是些什么物质?

8.       HPLC纯化的多肽中有哪些杂质?

9.       多长的多肽为合适?

10.   如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?

11.   为什么含有Cys, Met,Trp的多肽难合成?

12.   为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

13.   多肽是如何纯化的?

14.   做免疫用的多肽多长为合适?

15.   我们合成的多肽溶解性不好,多肽就有问题对吗?

16.   多肽状态是如何?

17.   如何溶解多?

18.   如何保存合成的多肽?

19.   多肽的两端应如何处理?是保持自由状态还是屏蔽起来?

20.   什么是电雾离子化质谱(Electrospray IonozationEIS)?

21. 什么是基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱(Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtryMALDI-TOF MS

22.   什么是高效液相色谱(HPLC)?什么是反相高效液相色谱(RP-HPLC)?

23.   反相HPLC法为什么采用梯度洗脱方法?

24.   在质谱图谱如何确定单一同位素峰和平均同位素峰?

25.   同位素峰之间一定是相差1Da吗?

26.   单一同位素峰一定是最高的峰吗?

27.   多肽分析除了HPLCMS分析还有那些分析?

28.   多肽一般所带的反离子是什么?

29.   同位素标记多肽能提供那些?

30.   影响多肽稳定性的因素有那些?

31.   Fmoc/tBu固相合成法(SPPS), 如何选择树脂?

32.   树脂的参数有那些?代表的含义是什么?

33.   Fmoc保护氨基酸树脂Loading的计算方法有那些?

34.   常用的荧光素修饰有那些?

35.   什么是FRET检测法

36.   常用的荧光基团和淬灭基团组合有那些?

37.   荧光修饰在序列中,在C端修饰时的方式有那些?

38.   请介绍一下Maps修饰的多肽情况?

39.   多肽PEG修饰有那些作用?

40.   多肽PEG修饰有那些方式?

41.   什么是小分子PEG

42.   假二肽(Pseudoproline Dipeptides)可以帮助困难多肽的合成吗?

43.   常见的抗体中抗原决定部位标签多肽(Antibodies to Epitope Tags)有那些?

44.   TAT peptide是什么

45.   怎样的多肽可以通过紫外分析来计算肽含量?

46.   吉尔可以提供那些环肽?

47.   点击多肽(Click Peptide)有那些修饰可以选择?

48.   侧连甲基修饰的氨基酸有那些?

49.   C端硫酯多肽应用在那里?

50.   多肽与其他化合物或者载体接合考虑的因素有那些?

51.   如何进行多肽分子量计算

52.   单位间如何进行换算?

 

 

1. 多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破。它的最大特点是不必纯化中间产物,合成过程可以连续进行,进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成,基本都是固相合成。其基本过程如下:

基于Fmoc化学合成,先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连,然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点,同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键,不断重复这一过程,即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同,多肽后处理方式不同,纯化方式也有差异。

 

2. 多肽定制服务的质量如何控制?

吉尔的多肽严格按照ISO质量管理体系进行生产,对每条多肽都进行唯一的编号管理,对粗品,纯化收集液以及最终冻干品进行三道HPLC以及MS检测分析,确保产品的正确性,产品的质量。

 

3. 吉尔多肽的生产能力以及交货时间如何?

公司直接从事多肽合成的一线人员增加至350人,另有一支250多人组成的高效液相色谱纯化队伍,公司每月产量达到10000条纯化肽,普通多肽可以一周时间交货,大部分可以二周内交货。数量从毫克到公斤级.

 

4. 常用什么方法生产多肽?

    线性多肽肽链的延伸采用Fmoc固相合成法,由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始,将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用六氢吡啶将Fmoc保护基去掉后,第二个Fmoc保护的氨基酸被连接了上去,连接方法有预活化或一锅煮等。目标序列连接完毕后,用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品。

 

5. 对不同的实验,如何选择肽的纯度?

肽的纯度是很重要的指标,纯度的选择取决于实验的目的。对不太灵敏的筛选实验,建议使用粗品或>75%,对免疫级别,建议选用>85%。对于受体与LIGAND相互作用的研究,生物ASSAY研究,或细胞水平的研究,建议>95%,对于结构研究,建议>98%

 

6. 什么是多肽的净含量(肽含量),它的意义是什么?

干品多肽的重量中不仅仅包含多肽,还包含有一些非肽的组份,如水,被吸收的溶剂、配位离子和盐等。肽的净含量是指肽在其中的重量百分比,这个百分比的数值范围很大,可能从50%90%,取决于纯度、序列以及合成和纯化的方法,不要将肽的净含量和肽的纯度混为一谈,它们是完全不同的两个概念。纯度通常是由HPLC决定的。纯度定义的是多肽样品中含正确序列的组分的百分比,而肽的净含量是指样品中肽类物质相对于非肽类物质所占的百分比,肽的净含量通常是用氨基酸组分分析或紫外分光法测定的。这个信息主要是在一些对肽的浓度很敏感的实验中,对计算肽的浓度是很重要的。

 

7. 如果我的肽纯度是95%,那么,其余的5%都是些什么物质?

多肽的纯度通常是通过HPLC,用每分钟1%的标准乙晴梯度来检测决定的。合成过程中,氨基酸之间的交联效率不是总能达到100%,因而产生一系列的氨基酸缺失的杂质。大多数这样的氨基酸缺失的杂质在纯化过程中都被去掉了,但有少数的杂质其色谱表现与目标多肽很相近。这些氨基酸缺失的杂质肽留在了多肽样品中就构成了余下的几个百分。

 

8. HPLC纯化的多肽中有哪些杂质?

粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质:如非全长多肽和多肽后处理的一些原料如DTTTFA等。

 

9. 多长的多肽为合适?

多肽合成需要考虑多肽的长度,电荷,亲疏水性等因素。长度越长,合 成粗品的纯度和产率都随着 降低,纯化的难度和无法合成的几率就会大些。当然多肽功能区的序列是无法改变的,但是为了多肽的顺利合成,有时不得不在功能取的上下游增加一些辅助氨基 酸,以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短,合成也可能有问题,主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否则后处理难度加大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。

 

10. 如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1) 多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,PheTrp,多肽很难溶解与水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成,都有可能有问题。

(2) 一般情况下疏水性氨基酸的比例<50%,不能连续5个连续aa为疏水性,带电荷的氨基酸的(正电荷K,R,H,N-terminus,负电荷D,E,C- terminus)的比例达到20%,在多肽的NC短如果能增加极性氨基酸,也可以改善溶解性。

 

11. 为什么含有Cys,Met,Trp的多肽难合成?

含有Cys,Met,或Trp的多肽难以合成,同时难以获得高纯度的产品。主要因为这些基团不稳定,易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意,避免反复开启盖子。

 

12. 为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

多肽合成与引子合成有比较大的区别,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,Thr这些氨基酸比邻或重复时,多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下几种情形,合成效率和产物的纯度都比较低,如:重复Pro,Ser-Ser,重复Asp4个连续Gly等。

 

13. 多肽是如何纯化的?

   多肽纯化一般使用反相柱(C8C18)214nm。缓冲体系通常为含TFA的溶剂,pH2.0Buffer A为含0.1%TFA in ddH2OBuffer B1%TFA/ACN/pH2.0。纯化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用Buffer B溶解后,然后用Buffer A稀释;对疏水性强的多肽,有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗产物,如果多肽不长(15aa以下),一般会有主峰,主峰通常为全长产物;对于20aa以上的长肽,如果没有主峰,HPLC需搭配Mass来判定分子量,进而确定哪个峰是所要合成的多肽。

 

14. 做免疫用的多肽多长为合适?

    一般约10-15个氨基酸,当然长一些免疫效果好一些,不过合成费用也会增加。MAP多肽则希望长度在15aa以上,效果较好。另外,10aa以下的多肽免疫效果比较差。

 

15. 我们合成的多肽溶解性不好,多肽就有问题对吗?

   很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。如果多肽难以溶解就认为多肽合成有问题这个观念并不正确。

 

16. 多肽状态是如何?

    我们提供的多肽是粉末状,一般为白色,组成不同,多肽粉末的颜色有差异,比如有FITC修饰的有些黄绿色等。

 

17. 如何溶解多肽?

    溶解多肽是非常复杂的事情,一般很难一下子确定合适的溶剂。通常是先取一点试验,在没有确定合适的溶剂前千万不要合部溶解。

下列方法有助于您选择合适的溶剂:

(1) 判定多肽的电荷特定,设定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)CCOOH-1;碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)NNH2+1,其它氨基酸的电荷为0。计算出将电荷数。

(2) 如果净电荷数>0,多肽为碱性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽还不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。

(3) 如果净电荷数<0,多肽为酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。

(4) 如果净电荷数=0,多肽为中性,一般需要用有机溶剂如乙腈,甲醇或异丙醇,DMSO等溶解。还有人建议需要尿素来溶解疏水性很大的多肽。

 

18. 如何保存合成的多肽?
    多肽一般长期保存需要避光保存,并应保存在-20度,短期可以保存在4度。可以短时间以室温运输。多肽在-20很稳定,特别是冷冻干燥并保存在干燥器中,在将它们暴露于空气之前, 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少,当无法冷冻干燥时,最好的方法是以小的工作样量存放。
   
对于含Cys, Met orTrP的多肽,脱氧缓冲剂对其溶解必不可少,因为这种多肽可易空气氧化,在封瓶前,慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含GlnAsn的多肽也容易降解,所有这些肽与不含这些有问题简单的那些肽相比,生命期有限。

 

19. 多肽的两端应如何处理?是保持自由状态还是屏蔽起来?
    多肽是用来模拟蛋白的,为了模仿蛋白的表现,我们需要合成与蛋白有相似的结构和电荷的多肽。当一条肽段从一个蛋白中“切出”之后,两端的电荷数将与基因体蛋白有差异。我们需要改变合成策略来使他们一致。 总体而言: 如果是出自蛋白C端的序列,通过乙酰化将N端屏蔽; 如果是出自蛋白N端的序列,通过酰胺化将C端屏蔽; 如果是出自蛋白中间部分,用乙酰化和酰胺化将两端都屏蔽。

 

20. 什么是电雾离子化质谱(Electrospray IonozationEIS)?

EIS可产生多价离子化的蛋白或多肽,允许相对分子质量达1×105蛋白进行分析,分辨率在1500-2000amu。精确度在0.01%左右。EIS更适合相对分子质量大的蛋白质的在线分析,且需要气化或有机溶剂使样品敏感化。

 

21. 什么是基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱(Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtryMALDI-TOF MS

MALDI-TOF是 目前蛋白质鉴定中精确测定测定分子质量的手段,特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定,灵敏度和分辨率均较高。它是目前蛋白质组学研究的必备 工具。同时结合液相色谱的联用技术可以高效率的鉴定多肽物质。特别是当各种原理的质谱技术串联应用时,不但可以得到多肽的相对分子质量信息,还可以测定它 的序列结构,此项技术将在未来蛋白质组学研究中起到决定性作用。

 

22. 什么是高效液相色谱(HPLC)?什么是反相高效液相色谱(RP-HPLC)?

HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。

反相高效液相色谱(RP-HPLC

结果与保留值之间的关系:利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在220氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在1060氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间,而含525个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。

 

23. 反相HPLC法为什么采用梯度洗脱方法?

目前,反相HPLC法是最常用的合成多肽有关物质研究方法。但是由于合成多肽中存在的有关物质的性质相差较大,采用简单的等度洗脱的方法往往很难充分检出产品中存在的各种有机杂质。

 

24. 在质谱图谱如何确定单一同位素峰和平均同位素峰?
    在分辨率低的质谱图谱上,所显示的峰一般是平均同位素峰。但目前常用的质谱方法(如 MALDI-TOF)的分辨率都很高,一般的小分子(如肽段)常含有4-5个同位素峰,其中分子量最小的是单一同位素峰。当用质谱检测大分子(比如完整蛋白质)时,同位素峰的数目很多,难以在图谱上区分。在这种情况下,使用平均同位素峰会更有意义。

 

25. 同位素峰之间一定是相差1Da吗?

    同位素肽段的质量(m)一般相差1Da,但因为质谱检测到的峰是肽段的质荷比(m/z),而不是质量本身,所以在肽段带有多个电荷的情况下,其质荷比相差要小于 1。如果检测到的肽段带一个电荷,同位素峰之间就相差1;如果检测到的肽段带2个电荷,同位素峰之间便相差0.5;如果检测到的肽段带3个电荷,那同位素峰之间便差0.33;以此类推。所以从同位素峰之间的间距,可以推断出肽段的带电情况(z),从而推断出肽段的单一同位素质量[(m/z)*z]

 

26. 单一同位素峰一定是最高的峰吗?

    单一同位素峰一定是一组峰里面质荷比最低的,但不一定是最高的。当肽段的分子量较小时,其所含的原子总数也少,所以整个肽段含有同位素原子的几率也比较小。这时,单一同位素峰往往是最高的峰。当肽段的分子量增大时,其带有同位素原子的几率也随之增大。在这种情况下,+1Da,甚至+2Da的同位素峰也有可能成为最高峰。统计结果表明,当肽段分子量超过2500Da时,最高峰往往不是单一同位素峰。

 

27. 多肽分析除了HPLCMS分析还有那些分析?

    还可以提供水份,离子色谱,元素分析,氨基酸组成分析,圆二色谱,NMR,IR,UV,内毒素,微生物等分析。

 

28. 多肽一般所带的反离子是什么?

    多肽冷干粉一般是提供的三氟醋酸盐,如果是做细胞实验或动物实验的建议转成醋酸盐或盐酸盐。

 

29. 同位素标记多肽能提供那些?

我们可以提供一些稳定同位素修饰的多肽,主要有N15, C13 以及D代修饰,由于稳定同位素氨基酸原料都比较贵,建议选择一些简单氨基酸进行标记,如Gly,Val,Phe,Leu,Ala等。

 

30. 影响多肽稳定性的因素有那些?

影响合成多肽稳定性的因素包括脱酰胺、氧化、水解、二硫键错配、消旋、β-消除、聚集等,研究显示合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中,天冬酰胺、谷胺酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下);甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸最易氧化,对光照也较为敏感;天冬氨酸参与形成的肽链较易断裂,尤其是Asp-ProAsp-Gly肽键。由于一个多肽分子中通常会含有多种不稳定性的氨基酸残基或肽键,因此合成多肽可能的降解机制和降解产物较为复杂。而多肽的聚集主要是由于疏水作用引发的,尽管目前还很难准确预测哪些多肽易发生聚集,但至少对于一些中长肽而言需对可能存在聚合物进行研究。

 

31. Fmoc/tBu固相合成法(SPPS),如何选择树脂?

   如果是合成C端是羧酸多肽以选择Wang Resin, 如果是合成C端是酰胺多肽可以择Rink Amide AM ResinRink Amide MBHA Resin. 如果是合成全保护多肽的可以选择2-Cl Trt Resin.

 

32. 树脂的参数有那些?代表的含义是什么?

通常树脂的参数有取代度(Loading),以及目数,以及规格如1%DVB.

取代度(Loading):单位是mmol/g  即每克树脂有多少mmol的官能团.

目数:颗粒大小 常用的是100-200Mesh 数值越大颗粒越细.

1%DVB: 交联剂二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物的比重.

 

33. Fmoc保护氨基酸树脂Loading的计算方法有那些?

计算Fmoc保护氨基酸树脂Loading通常有二种,一种是增重法,增加的重量除以增加的分子量再除以树脂总的重量. 另外一种是通过紫外分析,目前本公司提供的都是紫外分析的Loading.

 

34. 常用的荧光素修饰有那些?

Dye

Exnm

Emnm

FITC

488

518

5-FAM

490

520

5-TAMRA

544

572

TRITC

547

572

Mca

322

390

Amc

351

430

AFC

380

500

NBD

466

539

Dnp

350

 

Texas Red

589

615

Dabcyl

426

 

GluEDANS

335

493

  

 

 

35. 什么是FRET检测法

可以利用荧光共振能量传递(Fluorescence resonance energy transferFRET)原理进行检测,在合成的蛋白酶底物多肽两端分别标记荧光发光基团EDNAS和荧光猝灭基团DABCYLEDNAS355nm光波激发下能够发出最大发光波长为490nm的荧光,而猝灭基团DABCYL能够吸收荧光,其最大吸收波长也是490nm。当蛋白酶底物完整时,发光基团发出的荧光被猝灭基团吸收,整个反应体系不发光;当蛋白酶底物被切割后,发光基团离开猝灭基团,猝灭效应降低甚至消失,反应体系发出荧光。

 

36. 常用的荧光基团和淬灭基团组合有那些?

DABCYL/ EDANSDABCYL/6-FAMTAMRA/6-FAMAbz/Tyr(3-NO2), Mca/Dnp

 

37. 荧光修饰在序列中,在C端修饰时的方式有那些?

   通常荧光染料化合物带有羧酸或者NHS活化酯,所以与多肽接合时需要多肽有氨基官能团,所以通过在序列中可以修饰在Lys侧连氨基上,在C端时需要增加Lys或通过乙二胺(EDNH2CH2CH2NH2)连进行连接。如LysBiotin),ED-BiotinEDDnp等。

 

38. 请介绍一下Maps修饰的多肽情况?

   Maps是多重抗原多肽,是将线型多肽的C端连接在二个,四个等Lys上形成的分枝多肽,从而增大了整个分子的大小,通常有2支,4支,8支结构。合成Maps多肽时由于缩合时的不均一性,多肽产物与非目标肽性质相似,因而很难除HPLC纯化也很难提供质谱鉴定。建议进行氨基酸组分分析。

 

39. 多肽PEG修饰有那些作用?

   PEG修饰剂又称聚乙二醇修饰剂,修饰性PEGPEG修饰剂等。是带有官能团的聚乙二醇,目前主要用于蛋白质药物修饰,以增加体内半衰期,降低免疫原性,同时还可以增加药物的水溶性。近几年来修饰性PEG在制药研发中应用广泛,在药物药效缓释中起到重要作用。

 

40. 多肽PEG修饰有那些方式?

PEG修饰剂常见的修饰基团大致可总结如下:

  氨基(-Amine-NH2,氨甲基-CH2-NH2,马来酰亚胺-Mal,羧基-COOH,巯基(-Thiol-SH,琥珀酰亚胺碳酸酯-SC,琥珀酰亚胺乙酸酯-SCM,琥珀酰亚胺丙酸酯-SPA,琥珀酰亚胺-NHS,丙酸基-CH2CH2COOH,醛基-CHO,丙烯酸基-Acrylate,丙烯酸基-AC,叠氮基-Azide,生物素基-Biotin,荧光素基-Fluorescein,戊二酸基-GA,酰肼基-Hydrazide,炔基-Alkyne等。

PEG修饰剂常见分类:

  (1)直链PEG修饰剂  mPEG 

  (2)双官能团修饰剂

       HCOO-PEG-COOH

       NH2-PEG-NH2

       OH-PEG-COOH

       OH-PEG-NH2

       HCL·NH2-PEG-COOH

       MALPEGNHS  

    3)根据分子量的大小又有2000300050001000020000

所以在进行PEG化修饰时需要确定PEG的种类,官能团要求以及分子量大小范围。

 

41. 什么是小分子PEG

小分子PEG 是指分子量比较小,如mini-PEG有明确分子量的一端有氨基一端有羧酸的化合物,常用的有以下一些化合物

AEA       5-amino-3-oxapentanoic acid

AEEA      8-Amino-3,6-Dioxaoctanoic Acid   9 atoms mini-PEG

TTDS      1,13-diamino-4,7,10-trioxatridecan-succinamic acid

Ebes       8 - amino - 3,6 - dioxa - octyl)succinamic acid PEG2-Suc-OH  

AEEEA    11-Amino-3,6,9-Trioxaundecanoic Acid  11 atomsmini-PEG3

dPEG(4)    15-amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadecanoic acid

dPEG(8)    alpha-amino-omega-carboxy octa(ethylene glycol)

dPEG(12)   alpha-amino-omega-carboxy dodeca(ethylene glycol)

 

42. 假二肽(Pseudoproline Dipeptides)可以帮助困难多肽的合成吗?

是的,Pseudoproline Dipeptides可以在多肽缩合中,减少多肽的Alpha转角以及Beta折叠空间结构的产生,使得多肽保持线性,有利于多肽的合成,提高多肽的粗品纯度。Pseudoproline的结构在多肽用TFA切割时同时会去掉,得到正常的多肽。Pseudoproline Dipeptides主要有Fmoc-AA-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OHFmoc-AA-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH二大系列,AA代表氨基酸。如果有侧连的,侧连带保护。

Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi(Me,Me)pro)-OH    Fmoc-Asp(OtBu)-Thr(Psi(Me,Me)pro)-OH

 

43. 常见的抗体中抗原决定部位标签多肽(Antibodies to Epitope Tags)有那些?

Tag

Sequence

HIS

HHHHHH

c-MYC

EQKLISEEDL

HA

YPYDVPDYA

VSV-G

YTDIEMNRLGK

HSV

QPELAPEDPED

V5

GKPIPNPLLGLDST

FLAG

DYKDDDDK

 

44. TAT peptide是什么?

    TAT peptide 序列为Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg RKKRRORRR)可以携带多肽穿膜。

 

45. 怎样的多肽可以通过紫外分析来计算肽含量?

    如果多肽序列中有TrpTyr可以采用紫外的方法分析肽含量,根据摩尔消光系数:

Tryptophan 5560 AU/mmole/ml

Tyrosine 1200 AU/mmole/ml

at 280 nm at neutral pH using a 1-cm cell

一条多肽的摩尔消光系数可以根据每个TrpTyr的系数进行加和,然后根据所测到的在280nm处的吸收值通过公式进行计算

mg peptide per ml = (A280 x DF x MW) / e

A280   280 nm实际吸收值(1-cm cell,

DF   是稀释因数, MW 多肽分子量

e     多肽的摩尔消光系数

 

46. 吉尔可以提供那些环肽?

    环肽包括Cys-Cys之间形成的硫硫键(S-S),即氧化肽,可以提供一对S-S,二对S-S,三对S-S的多肽合成,也可以提供多肽分子间的氧化,包括同一条多肽间形成二聚体,二条不同多肽间的氧化等。另外也提供酰胺成环,包括头尾环肽,侧连环肽等。也可以提供一些酯键,硫酯键等环肽的合成。

 

47. 点击多肽(Click Peptide)有那些修饰可以选择?

点击化学的代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应(Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Cycloaddition)。点击化学的概念对化学合成领域有很大的贡献,在药物开发和生物医用材料等的诸多领域中,它已经成为目前最为有用和吸引人的合成理念之一。具体在多肽中应用主要是在多肽中带有叠氮基或炔基官能团,常用的化合物有以下几种可以选择。

Fmoc - 4 – azidophenylalanine    Fmoc - Phe(N3) - OH;

Fmoc – Azidohomoalanine

Fmoc - D – propargylglycine   Fmoc - D - Pra - OH

Fmoc - L - propargylglycine    Fmoc - L - Pra - OH

Fmoc - Lys(N3) – OH Fmoc - azidolysine; Fmoc - lys(azide);

Azidoacetic acid

6-Azidohexanoic acid

Propiolic acid

 

48. 侧连甲基修饰的氨基酸有那些?

    主要有Lys(Me), Lys(Me2), Lys(Me3) 以及Orn(Me), Orn(Me2), Orn(Me3)

   Arg(Me), Arg(Me2,Symetrical) , Arg(Me2,ASymetrical

 

49. C端硫酯多肽应用在那里?

    多肽C端硫酯修饰后可以应用于Native chemical ligation反应,与另外一条N端为半胱氨酸的多肽在中性条件下发生化学选择之硫酯转移反应(chemoselective transthioesterification),重排成酰胺键,实现二条多肽间的连接。可以应用于长肽通过片段进行连接。

 

50. 多肽与其他化合物或者载体接合考虑的因素有那些?

    经常有一些多肽需要与一些药物或者特定功能的化合物进行连接,或者要把多肽连接到某些载体上去,需要化学键进行结合,一般多肽具有氨基或羧酸官能团可以考虑下相应的羧酸或氨基进行缩合,另外一种选择是通过巯基(thiol)与马来酰亚胺(Maleimide)在PH 8的环境下连接。多肽中可以同过带有Cys或者Maleimide官能团进行修饰。Maleimide修饰通常可以选择化合物3-Maleimidopropionic Acid (CAS 7423-55-4)实现。

 

51. 如何进行多肽分子量计算

多肽分子量的计算可以通过一些软件如peptide companion,也可以在一些网站上直接输入序列得到分子量,由于计算上小数点的差异,分子量小数部分可能会有所不同。

 

52. 单位间如何进行换算?

1mg=1000 mcg (或 ug

1ml=1000uL

1摩尔(mol)=1000毫摩尔(mmol)

1毫摩尔(mmol)1000微摩尔(μmol)

1微摩尔(μmol) = 1000纳摩尔(nmol

1纳摩尔(nmol=1000皮摩尔(pmol

 

 

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