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分析测试
 

1. 吉尔在产品的质量控制方面与其它企业相比有哪些优势?
吉尔质量控制部门拥有一支专业测试人员队伍,对公司的产品提供比较完整,准确的测试数据,同时公司也为测试人员包括一些大型测试设备,包括核磁共振谱仪,液质联用仪,元素分析仪,氨基酸分析仪,离子色谱等等,大部分常见的测试项目都能在公司内部完成。
 
2. 吉尔在氨基酸手性分析开发上有哪些优势?
吉尔质量控制部门拥有多种手性固定相的色谱柱,已经开发了公司95%以上氨基酸产品的手性分析方法,并取得了良好的分离效果,为客户的研发和生产提供光学纯度数据。
 
3. 含有CYS的氧化肽在纯化后进行质谱分析时有什么需要注意的?
在进行质谱(ESI源)分析时需要注意质谱图中是含有分子间氧化的产物,因为有些分子内氧化多肽和分子间氧化多肽在HPLC无法完全分离,或者分离条件不合适,容易造成误判。
 
4. 多肽在做LCMS或者MS分析时,常用的溶剂有哪些?
首选的溶剂有去离子蒸馏水,色谱乙腈,色谱甲醇等,有时也会用到分析纯DMF,分析纯DMSO等,有些多肽用DMSO溶解后会影响样品的电离效果,造成测试效果不好,只有其它溶剂溶解不好或者调整PH值无法溶解多肽时才使用DMSO溶解。
 
5. 多肽MS分析过程中常用的调整PH的酸碱溶剂有哪些?
根据多肽的序列不同,如果酸性氨基酸比例在整个序列中的比例较高时可以在多肽溶解过程中加些稀氨水,这样有利于形成去氢的带负电荷分子离子峰:
M-COOH+B —〉 [M-COO]-+ BH+
如果碱性氨基酸比例较高时可以在多肽溶解过程中加些冰醋酸或者甲酸,这样有利于形成加氢的带正电荷分子离子峰:
M-NH2+AH —〉[M-NH3]+ +A-
 
6. 液相分析过程中需要配制缓冲盐体系和有机溶剂的混合流动相时需要注意哪些方面?
1)配制缓冲盐体系时一般浓度不超过0.1M/L,溶解后需要用0.45μm水相滤膜过滤。
2)缓冲盐与有机溶剂混合时需要注意不要将少量体积的缓冲盐加入到大量体积的有机溶剂中,否则会使缓冲盐析出,一般建议混合时有机相的体积比不超过60%
3)做完缓冲盐体系流动相的色谱系统需要用大量的水来冲洗,最好能用加热到40-50摄氏度的水来冲洗,这样效果会更好,色谱柱要用至少10%/90%有机溶剂的流动相来冲洗,一般要用几十倍柱体积的流动相来冲洗。
 
7. 供试品进样前需要现溶现配吗?
有些多肽和氨基酸样品配制一段时间后容易发生变化,比如峰形有变化或者会多出一些杂质峰,我们在测试过程中就遇到这样的样品,一般建议在走完空梯度后在平衡好色谱系统前5分钟进行样品的配制工作,等色谱体统的基线平衡好后就可以进样。
 
8. 分析多肽,氨基酸衍生物,多肽缩合试剂等产品的HPLC分析体系中除了长用的0.1%TFA体系外还用到哪些体系?
有些样品在0.1%TFA体系中分析时会造成样品发生有些活泼官能团的变化,所以有些样品我们还会选择在水相和有机相中添加一定比例的甲酸,冰醋酸或者磷酸等。
 
9. 比旋度测试过程中测试温度对测试数据有影响吗?
比旋度的药典测试温度定在20± 0.5 ,一般建议用带恒温水浴的循环的旋广管来测试比旋度,温度控制时测试数据要准确,特别是有些样品对温度比较敏感,这些样品就需要准确控制测试的温度。
 
10. 液相色谱系统在做正相体系时应该怎么处理?
正相体系一般含有正己烷和醇类, 正己烷与多种溶剂不溶,特别是水,所以我们在做正相体系前和做完正相体系后都会用过度溶剂-异丙醇冲洗系统,异丙醇的粘度比较大,背压较大,一般以低流速冲洗系统,冲洗完后才能换上反相体系的流动相。
 
11. 测多肽含量方法
现在的药品标准测多肽含量常用的方法是福林酚法。也有考马斯亮兰法测蛋白含量。我们公司运用元素分析测定N含量,得出肽含量,该方法简单、快速。
 
12. 氨基酸的一般显色反应
蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除α-氨基酸中的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外,其它氨基酸生成紫红色,最终为蓝色化合物
 
13. 如何解释MALDI(MS)中的P+Na P+K峰?
A经常会在MALDI中看到Na峰和K峰,钠和钾来源于溶剂水。即便是蒸馏水和去离子水也会含有痕量的钠离子和钾离子,无法完全除去。它们在进行质谱分析时也会离子化并与肽的自由羧基结合。因为没有纯化水的系统将水中的钠离子和钾离子除去,所以有时候在MALDI MS图谱中出现钠峰和钾峰也是再所难免的。
 
14. 一般多肽TLC用什么扩展剂?
用氯仿甲醇系统 比较多 
 
15. 多肽滴定
小肽的滴定曲线与侧链含有可解离基团的氨基酸的滴定曲线差不多,但随着肽链的增长,侧链可解离基团的增多,其滴定曲线将变得很复杂。多肽在水溶液中以何种解离形式存在,与溶液的pH值密切相关,如已知多肽各解离基团的pK’值,就很容易知道在某一pH条件下,多肽各解离基团的存在形式。当多肽以净电荷为零的离子形式为主要存在形式时,这时溶液的pH值就是该肽的等电点pI
 
16. 多肽的HPLC分离方法
多肽的HPLC 模式主要有三种: 一是凝胶过滤色谱, 按照肽分子的大小进行分离, 二是离子交换色谱, 按肽分子所具有的带电基团的性质和数目进行分离; 三是反相色谱, 按照肽分子的疏水性强弱进行分离。
 
17. 氨基酸类产品做哪些分析项目控制质量?
每批产品入库前测试核磁、质谱、红外、旋光、熔点、HPLC、澄清度、手性、水分等等以确保每批产品的质量合格,满足客户需要。
 
18. 乙酸酐在非水滴定的标准溶液中起什么作用?
浓度低时,起脱水剂的作用。浓度高时,滴定剂活性越强,使平衡移动。
 
19. 气相色谱仪有哪些系统组成?
载气系统、进样系统、分离系统、温控系统、检测系统、记录系统
 
20. 毛细管柱老化的目的?
把固定相残留溶剂、低沸点杂质、低分子量的固定液等赶走,使工作站基线平直,并在老化稳定下使固定液在担体表面有一个再分布过程,使涂得更加均匀牢固。
 
21. 为什么要进行N端乙酰化,C端酰胺化修饰?
A:这些修饰可以使肽不会被降解掉,也可以使肽模拟它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始状态。
 
22. 如果想在N端做生物素修饰,需要在生物素和肽序列之间加一个间隔吗?
用的标准的生物素标记程序是先往肽链上连一个Ahx,然后再连生物素。Ahx是一个6碳化合物,把它加在肽和生物素之间起到间隔的作用。
 
23. 什么样的保存条件是最好的?多肽的稳定性怎样?
多肽冻干后呈绒毛状或絮状粉末,可避免多肽的过早降解。建议贮存条件为: a. -20贮存或者在干燥环境中贮存 b. 尽量避免反复冻融 c. 尽量避免以溶液状态贮存(为使用方便可以将冻干粉分装后贮存) d. 如果必须以溶液状态贮存,建议用无菌水在弱酸性条件下溶解多肽并于-20贮存.
 
24. 什么是净重?什么是肽含量?
肽冻干后一般呈现为蓬松的绒毛状,由于肽本身的特性决定了其中可能仍然含有痕量的水分、吸附的溶剂及盐分等。这不代表肽的纯度不够,仅仅是影响肽的实际含量,使其降低了10%30%。肽的净重是指肽的实际重量减去水分和质子化离子后的重量。为保证肽的浓度,需要从粗品肽中把非肽物质去除。
 
25. 贮存时间太长的多肽样品可能出现一些问题
冻干多肽通常稳定性较好,一般来讲冻干多肽在-10 或更低温度条件下能贮存几年而不会降解。但如果以溶液状态保存,其稳定性就会受到影响。由于多肽会被微生物、细菌和蛋白酶降解,因此最好用无菌溶液溶解多肽,可以用无菌水、蒸馏水溶解,或者溶解后过滤除菌。对于那些含有MetCysTrp的肽,由于氧化作用会产生其它杂质或使其丧失生物学活性,因此,含有上述氨基酸的肽应该用无氧溶剂溶解。
 
26. 肽的纯度、含量、总重与实际重量
根据总重和HPLC分析的纯度,样品中目的肽的含量是如何确定的呢?我公司的多肽发货时是以总重来计算的,也就是肽冻干后的实际重量,其中包括在冻干过程中,其它杂质如残留的水分、来自带相反电荷离子的盐分等的重量。
肽的纯度是指在波长214nm时样品中目的肽所占的比例,样品中可能含有缺失序列、短片段、脱保护不完全的序列等等。肽的纯度是在肽的最大吸收峰214nm处由HPLC分析而得到的,肽中一般还含有水分和盐分,但肽的纯度没有把它们计算在内。
肽的含量是指所有肽在样品中所占的百分比,样品中包含所有的肽及水分、盐分等,肽的含量通过氨基酸分析得到。
目的肽的绝对含量是指在样品中目的肽的纯度与其含量的乘积。
 
27. 氨基酸和羟基树脂的连接方法主要有哪些?
主要有 3种:对称酸酐法    连接率不高 ( 3 0 ~ 8 0 ) ,也不稳定,保护氨基酸用量大 ( 多肽合成仪中氨基酸的过量高达 l 0) ,且随氨基酸的不同连接率有较大的差异。
活化酯法连接率达 8 0 %。
DCB法操作步骤简单;但是连接率也不高 ( 5 5 %一 6 6 ) ,反应时间长,一般需要 1 5 h 2 0 h
 
28. 多肽的化学合成法
主要有液相法与固相法。与液相法相 比,固相法工艺简单且产品产率高。而固相合成法又分为 B o c B ~ l 正交保护策略和 F mo c t B u 正交保护策略
B o c B z l  正交保护策略使用三氟醋酸脱除 B o c 保护基 ,容易产生较多
副反应;而且最后使用毒性很大的强酸氢氟酸切割 多肽。 
 F mo c t B u正交保护 固相合成策略则反应条件温和,使 用哌啶脱除 F mo c保护基,切割 多肽使用 的是 三氟醋 酸,避免了采用氢氟酸。F mo c t B u固相合成法还具有副反应少及产率高等优点。
 
29. 吉尔的多肽采用何种合成方法
吉尔的产品液相法和固相法都能完成。
 
 
 
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